9月18日，中國科學(xué)院上海營(yíng)養與健康研究所翟琦巍研究組在國際學(xué)術(shù)期刊Nature Communications在線(xiàn)發(fā)表了題為“Discovery of the major 15-30 nt mammalian small RNAs, their biogenesis and function”的研究論文。該研究通過(guò)生化分析、新型高通量測序等多種分析鑒定技術(shù)，發(fā)現了哺乳動(dòng)物中長(cháng)度為15-30個(gè)堿基(Nucleotide, nt)范圍內的主要的小RNA是3’環(huán)磷酸小RNA，初步揭示這些3’環(huán)磷酸小RNA的產(chǎn)生機制，并發(fā)現其可以存在于A(yíng)go2復合物中，以類(lèi)似于microRNA的方式結合到mRNA的3’非翻譯區(3’-UTR)從而引導目的mRNA的降解，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能。該項研究拓展了對哺乳動(dòng)物小RNA的認識，揭示了哺乳動(dòng)物中15-30nt長(cháng)度范圍內的大部分未知小RNA，特別是環(huán)磷酸小RNA，初步揭示其產(chǎn)生機制，并發(fā)現其具有類(lèi)似microRNA的重要生物學(xué)功能。
小RNA是一類(lèi)生物體內具有重要生物學(xué)功能、通常長(cháng)度小于200nt的RNA。目前在15-30 nt長(cháng)度范圍內已經(jīng)發(fā)現了多種類(lèi)型的小RNA，例如microRNA、piRNA、tRNA-derived small RNA (tsRNA)以及small rDNA-derived RNA (srRNA)等。然而，這些小RNA是否是15-30 nt長(cháng)度范圍內的主要小RNA還并不清楚。
研究人員使用小鼠肝臟分離純化了大量的15-30nt長(cháng)度的小RNA，讓這些小RNA通過(guò)常規的電泳染色就能清晰觀(guān)察到。隨后，通過(guò)T4 RNA ligase 2催化的3’羥基(3’-OH)小RNA與5’預腺苷化接頭的連接反應，發(fā)現這些15-30nt長(cháng)度的小RNA絕大多數并不是3’-OH；僅當使用T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase, T4 Pnk)催化處理后，才能幾乎全部被連接上接頭。進(jìn)一步的質(zhì)譜分析及大量不同細胞或組織的多種生化分析發(fā)現，哺乳動(dòng)物15-30nt長(cháng)度的小RNA的3’末端主要為環(huán)磷酸(2’,3’-cyclic phosphate, 2’,3’-cP)，含量約為90%，這些小RNA可以稱(chēng)為3’環(huán)磷酸小RNA (sRNAs with 3’-cP, sRNA-cP)。為了進(jìn)一步解析這些sRNA-cP，研究人員建立了一種可以在一個(gè)樣品中同時(shí)檢測sRNA-OH和sRNA-cP的新型高通量測定小RNA序列信息的方法，稱(chēng)為T(mén)ANT-seq (T4 Rnl2/AP/NaIO4/T4 Pnk (3’ phosphatase minus)/RtcB-based sRNA-seq)。基于TANT-seq高通量測序，揭示了大量的sRNA-cP和sRNA-OH的序列信息，并發(fā)現sRNA-cP和sRNA-OH通常具有不同的序列。
為了便于分析不同3’末端的小RNA，研究人員建立了一種可以同時(shí)檢測3’-OH、3’-P和3’-cP的基于定量PCR的技術(shù)方法TE-qPCR (triplex-3’-end qPCR)。基于TE-qPCR技術(shù)方法對許多sRNA-cP和sRNA-OH進(jìn)行了驗證，并發(fā)現很多sRNA-cP和饑餓、肥胖、糖尿病等生理病理狀態(tài)有關(guān)，提示sRNA-cP有重要的生物學(xué)功能。
哺乳動(dòng)物15-30nt長(cháng)度的小RNA主要為sRNA-cP，但這些小RNA究竟是在分離純化RNA過(guò)程中隨機降解產(chǎn)生的，還是在細胞內特異性加工產(chǎn)生的還有待解答。通過(guò)對sRNA-cP的末端序列特征分析發(fā)現，其3’末端主要為嘧啶堿基，而5’末端主要為嘌呤堿基。根據已知的細胞內各種RNA內切酶的序列識別特征，通過(guò)逐步的體外篩選以及后續的基因敲除和過(guò)表達等技術(shù)發(fā)現，ANG和RNase4介導了部分sRNA-cP的產(chǎn)生。
有研究報道microRNA、tsRNA、srRNA、snoRNA、snRNA、sinRNA、smRNA、piRNA、srpRNA以及smcRNA等小RNA都可以和Ago2結合，特別是microRNA已經(jīng)被廣泛報道可以通過(guò)和Ago2結合靶向目標mRNA的3’非翻譯區從而降解目標mRNA或抑制其翻譯。哺乳動(dòng)物15-30nt長(cháng)度的主要小RNA sRNA-cP是否也可以類(lèi)似于microRNA和Ago2結合，從而發(fā)揮生物功能呢？研究人員通過(guò)免疫沉淀獲得了Ago2復合物，隨后抽提獲得了Ago2復合物中的RNA，并通過(guò)TANT-seq測序分析了其中的小RNA。研究發(fā)現Ago2復合物中，最主要的15-30nt小RNA也是sRNA-cP，含量約為80-90%，而microRNA僅占sRNA-OH的約10%，相當于A(yíng)go2復合物中sRNA-cP的含量大約為microRNA的近100倍。Ago2中這么大量的sRNA-cP，如果大部分都能發(fā)揮生物學(xué)功能，其作用和意義甚至有可能會(huì )高于microRNA。
為了研究這些Ago2復合物中的sRNA-cP的生物學(xué)功能，研究人員參考microRNA進(jìn)行了生物信息學(xué)預測，通過(guò)熒光素報告基因篩選了一系列可能靶向的3’-UTR。從40個(gè)候選sRNA-cP預測的107個(gè)靶向的3’-UTR中，篩選出16個(gè)sRNA-cP和對應的18個(gè)3’-UTR正反向都能有兩倍以上的調控效應。進(jìn)一步的研究發(fā)現其中大部分都能正反向有效調控相應的mRNA水平，并且其中有些還進(jìn)一步驗證了相應的正反向的對于蛋白表達水平的調節作用。其中發(fā)現的snR-2-cP可以通過(guò)依賴(lài)于A(yíng)go2的方式，靶向著(zhù)名的抗凋亡基因Bcl2的mRNA的3’-UTR靶位點(diǎn)，下調Bcl2的mRNA和蛋白水平，從而調控細胞凋亡。
為了進(jìn)一步驗證sRNA-cP是否可以結合Ago2并引導識別和剪切靶序列，研究人員分離純化轉染了特定小RNA的Ago2復合物，在體外添加相應的小RNA識別的靶序列。在該體外研究體系中可以清晰觀(guān)察到sRNA-cP可以序列特異性地引導對于靶序列的識別和剪切，并且對于靶序列的剪切位置與microRNA一致，都發(fā)生在與小RNA互補的靶序列的第10和第11個(gè)堿基之間。此外，通過(guò)直接分離純化Ago2復合物，在體外添加相應的小RNA和小RNA識別的靶序列，也發(fā)現具有相一致的效果。進(jìn)一步研究發(fā)現，sRNA-cP發(fā)揮作用時(shí)不依賴(lài)于其3’-cP。
該研究工作開(kāi)辟了小RNA研究的新方向，為后續大量sRNA-cP的生理病理相關(guān)性及其生物學(xué)功能揭示奠定了基礎，也將對整個(gè)小RNA研究領(lǐng)域產(chǎn)生重要影響，有望成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的里程碑性工作。
中國科學(xué)院上海營(yíng)養與健康研究所賴(lài)和勁博士和馮寧博士為該論文共同第一作者。翟琦巍研究員為該論文的通訊作者。該研究工作得到了科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金委、中國科學(xué)院戰略性先導科技專(zhuān)項、中國科學(xué)院前沿科學(xué)重點(diǎn)研究項目和上海領(lǐng)軍人才項目等的資助，也獲得了中國科學(xué)院上海營(yíng)養與健康研究所公共技術(shù)平臺和動(dòng)物平臺的支持。
哺乳動(dòng)物15-30nt主要小RNA的分析鑒定及其產(chǎn)生機制和功能的示意圖
官方微信
